平時(shí)在實(shí)驗(yàn)室常聽到的一句話就是“今天某某試驗(yàn)沒做好是為什么？今天某某試驗(yàn)沒出結(jié)果是什么原因？今天某某試驗(yàn)為什么會(huì)是這樣的呢？” 等等。

然后仔細(xì)一查找原因，往往是由于操作上面的不認(rèn)真，或是一些小小的細(xì)節(jié)沒有注意到。以下是集各路朋網(wǎng)友的一些實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)，在此與大家分享：

1. 跑page膠的時(shí)候

小電壓跑會(huì)避免高電壓產(chǎn)生的熱量爾導(dǎo)致的膠層變形。低電壓泳道會(huì)比大電壓泳道跑的直一些，且分離效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分離。

2. 提取質(zhì)粒的時(shí)候

后一步的酒精揮發(fā)很關(guān)鍵，基本上是其后續(xù)的酶切反應(yīng)的決定性因素。所以這一步盡量揮發(fā)長一點(diǎn)時(shí)間，是空調(diào)吹熱風(fēng)，或是37度溫箱放長一點(diǎn)的時(shí)間，我試過室溫過夜，酶切很好。

3. 做WESTERN BLOT 的時(shí)候

大家往往會(huì)摸索一抗、二抗的濃度，封閉時(shí)間，曝光時(shí)間等等，而每次變換其中的一個(gè)條件就需要從新跑膠、轉(zhuǎn)膜，甚至重新提蛋白，這樣會(huì)浪費(fèi)大量的時(shí)間。其實(shí)*沒有必要這樣。一次轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜晾干，裁減成小塊，保存起來，用的時(shí)候取出一塊，沒有任何影響。這對(duì)于摸索條件的戰(zhàn)友來說，節(jié)約了大量的時(shí)間。

4. 有關(guān)緩沖液和培養(yǎng)基配置

1)將緩沖液配方中的成分分別以10-100倍配成母液儲(chǔ)存，需要的時(shí)候只需將相應(yīng)的母液混合，補(bǔ)加水稀釋即可。

2)配培養(yǎng)基時(shí)通常會(huì)忘記各成分的量，如配LB時(shí)的三個(gè)成分不記得到底哪個(gè)是5g，哪個(gè)要10個(gè)，因此可以在常用的試劑瓶的標(biāo)簽上注明所需的量，如配LB時(shí)，在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等，很方便，不需要每次配之前臨時(shí)翻書。

5. 有關(guān)PCR主反應(yīng)液配置

在做克隆鑒定的時(shí)候經(jīng)常需要在酶切鑒定前進(jìn)行PCR鑒定，每次配置PCR反應(yīng)液很繁瑣，可以將其配置類似kit的形式，按你需要的反應(yīng)體系列表，然后放大100倍配置100×主反應(yīng)液(100次反應(yīng))，其中含buffer，Mg2+，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10×分裝或一管儲(chǔ)存在-20度，在需要的時(shí)候拿出融開，然后按所需的PCR反應(yīng)個(gè)數(shù)吸取相應(yīng)的倍數(shù)，再補(bǔ)加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的Taq和引物，混勻后分裝，這樣做的好處如下：

1)可極大的節(jié)省寶貴的時(shí)間，可早點(diǎn)收工，看球；

2)避免每次反應(yīng)加樣不均的可能；

3)大大減少PCR假陽性的產(chǎn)生。

6. 有關(guān)酶切反應(yīng)液的配置

在做酶切時(shí)，也可以象PCR一樣配置主反應(yīng)液，每次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系，算好需要的反應(yīng)數(shù)，然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大，加入buffer、酶、水，質(zhì)粒欄空缺，然后混合后按除質(zhì)粒DNA的體積分裝，然后再在每管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒DNA酶切，這樣做的好處如下，特別是當(dāng)同時(shí)有10幾個(gè)陽性克隆需要鑒定時(shí)尤為明顯：

1)各反應(yīng)成分均一；

2)可大大減少限制型內(nèi)切酶的使用；

3)節(jié)省時(shí)間。

7. 有關(guān)SDS－PAGE：

1)可將SDS-PAGE的積層膠，分離膠預(yù)先配好大體積如100ml儲(chǔ)存在4度冰箱(注：10%AP，TEMED不加，切記!!!)，每次配置時(shí)只需吸取相應(yīng)體積的預(yù)制膠加入AP，TEMED即可，沒必要每次制膠時(shí)候翻分子克隆，特別方便，而且，這樣的預(yù)制膠可儲(chǔ)存半年以上，不失為偷懶的方法;更關(guān)鍵的是可大大減少與丙稀酰胺的接觸，因此大大減少中毒的機(jī)會(huì)。2)電泳時(shí)雖然小電泳分離效果要好一些，但2小時(shí)以上的等待的時(shí)間實(shí)在是痛苦，因此可以提高電泳至150V，但需要將整個(gè)電泳槽放在放滿冰水的臉盆里散熱，這樣跑出來的膠分離效果絲毫不比低電壓來的差，關(guān)鍵是時(shí)間大大節(jié)省，不需1h即可看結(jié)果了。